Проточная цитометрия (флоуцитометрия)

Все это достигается тем, что используется конический сопловой аппарат с геометрическими параметрами, позволяющими получать ламинарный поток жидкости, что представляет важное условие корректного измерения. За счет давления проточной жидкости регулируется диаметр потока клеток: чем меньше это давление, тем шире поток клеток, и наоборот. Разность давлений между потоком клеток (более низкое давление) и потоком «обжимающей» жидкости (более высокое давление) выталкивает клетки, частицы наружу друг за другом. Далее испускаемый или отраженный клеткой световой сигнал измеряется и анализируется.
2. Оптический блок. После окрашивания клеток флуоресцентными красителями или флуоресцентно мечеными антителами свет, который излучает лазер, вступает во взаимодействие с флуоресцентными красителями и вызывает вынужденное излучение когерентных волн света с одинаковой длиной волны, фазой и поляризацией. Диаметр лазерного луча в точке фокуса составляет около 20 мкм вдоль проточного канала и 60 мкм поперек него, что обеспечивает быстрое пересечение клеткой пучка (в этом случае в пучке одновременно присутствует только одна клетка) и достаточно равномерное освещение по всей ширине потока клеток.
Флуоресцентные сигналы, которые появляются как результат взаимодействия лазерного излучения с клетками, фиксируются детекторами, ориентированными по ходу лазерного луча, а также перпендикулярно к нему. Популярные лазеры, используемые для проточной цитометрии: аргоновый лазер, который излучает свет в синем диапазоне (488 нм), фиолетовый лазер (405 нм), красный диодный лазер (635 нм) [3].
3. Блок обработки электронного сигнала и вывод данных. В процессе прохождения клетки через оптическую систему проточного цитометра рассеивание света или флуоресценция, вызванные каким-либо флуорохромом, который располагается на поверхности или внутри клетки, выявляются разными фотодекторами или фотоэлектронными умножителями (ФЭУ), преобразующими информацию о показателях клетки в обработанную запись компьютером.
Каждой анализируемой клеткой создается событие для каждого измеряемого параметра (боковое светорассеяние, прямое светорассеяние, интенсивность флуоресценции в соответствующем детекторе). Разными типами клеток демонстрируются конкретные сигналы для различных параметров.
При прохождении клетки через луч света, свет, который рассеивается в прямом направлении (преимущественно под углом 20 С к прямому ходу лазерного луча), называют прямым светорассеянием и фиксируют детектором, называемым детектором прямого светорассеяния (FSC) [3]. В данном направлении интенсивность рассеянного света является пропорциональной размеру самой клетки. Лазерные лучи отражаются от поверхности ядер клеток, а также от различных внутриклеточных структур.
Свет, который рассеивается под углом 90 С − боковое светорассеяние, фиксируется детектором (SSC) [3]. Данный параметр показывает оптическую плотность цитоплазмы клеток, гранулярность клетки и характер клеточных включений. С помощью фиксации бокового светорассеяния можно делать вывод о сложности внутреннего строения клетки, связанной, к примеру, с присутствием гранул, шероховатой поверхностью мембраны или спецификой ядра, приводящими к повышению интенсивности бокового светорассеяния.
Из световых сигналов преобразуются электрические импульсы, фиксируются ФЭУ, затем проходят обработку с помощью логарифмических и линейных усилителей.