Флуориметрия в фарм анализе

Целью данной курсовой работы является изучение методик флуоресцентного качественного и количественного анализа лекарственных веществ.

Способностью флуоресцировать обладают многие вещества с определенными конфигурациями электронов. Такие конфигурации складываются в некоторых атомах, молекулах и надмолекулярных комплексах. Однако требуются специальные исследования для выявления потенциальной «способности» флуорофора выступать в роли молекулярного репортера для биологических и медицинских исследований. «Способности» эти оцениваются по специфичности информации, которую они передают, их стабильности, в первую очередь фотостабильности, в ряде случаев учитывается токсичность для отдельных клеток или организма. Особенностью флуоресцентных «корреспондентов» является их высокая индивидуальная «специализация». «Специализация» каждого репортера характеризуется по взаимодействию с определенными компонентами биологической системы, а также по специфичности флуоресцентных сигналов. Условно можно выделить две группы репортеров, созданных на основе органических и неорганических флуорофоров.
Органические молекулы- флуорофоры представляют наиболее многочисленную и разнообразную группу флуоресцентных репортеров. Большое разнообразие органических флуоресцентных репортеров обусловлено широким спектром задач и условий их применения. При выборе или при разработке репортеров принимаются во внимание информация, которую нужно получить, спектральные свойства флуорофора, а также специальные условия, связанные с особенностями исследуемой системы. Проиллюстрируем это на примере флуоресцеина и его производных (рис. 5). Как уже отмечалось, этот флуорофор имеет высокий квантовый выход и, соответственно, яркую флуоресценцию. Он может выступать в роли репортера рН. Однако, например, для измерения рН внутри клеток он не подходит, так как не проникает через цитоплазматическую мембрану. Его «доставка» в клетки может быть осуществлена с использованием гидрофобного производного — флуоресцеиндиацетата, который утратил способность флуоресцировать, но может проникать через гидрофобный барьер цитоплазматической мембраны. В клетках эстеразы отщепляют ацетильные группировки, и флуоресцеин оказывается в клетках. Аналогичным образом доставляется в клетки дихлорфлуоресцеин, т.е. через эстерифицированное производное. Этот репортер служит для регистрации наличия в клетках активных форм кислорода. Введение изотиоцианата в молекулу флуоресцеина дает возможность присоединять флуорохром к аминогруппам не флуоресцирующих молекул. С использованием флуоресцеинизотиоцианата создаются высокоспецифичные флуоресцирующие белковые репортеры — различные антитела, стрептавидин (реагент на биотин), а также нуклеотиды и олигонуклеотиды. Наконец, 5-карбоксиметокси-2-нитробензиловый эфир флуоресцеина (не показан на рис. 4) представляет собой не флуоресцирующее производное, которое может превращается в обычный флуоресцеин при облучении светом с длиной волны 355 нм. Это пример фотоактивируемых флуорофоров, флуоресцентные свойства которых как бы «спрятаны» (англ. «caged») до облучения.

Флуоресцентные методы основаны на способности веществ флуоресцировать в УФ-свете. Эта способность обусловлена структурой либо самих органических соединений, либо продуктов их диссоциации, сольволиза и других превращений, вызванных воздействием различных реактивов.
Флуоресцирующими свойствами обладают обычно органические соединения с симметричной структурой молекул, в которых имеются сопряженные связи, нитро-, нитрозо-, азо-, амидо-, карбоксильная или карбонильная группы. Интенсивность флуоресценции зависит от химической структуры и концентрации вещества, а также других факторов.
Флуориметрия может быть использована как для качественного, так и для количественного анализа.
Флуориметрию используют при количественном определении очень малых количеств вещества в анализируемом растворе. С флуориметрическим методом могут конкурировать лишь более селективные методы анализа – эмиссионная спектроскопия или масс-спектроскопия.