Биологическая активность липидов гороха и их роль в здоровье человека

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИПИДЫ И ИХ КЛАССИФИКАЦИЯ

1.1 Липиды

1.2 Функции и строение липидов

1.3 Классификация липидов

1.4 Физические и химические свойства липидов

2. ЛЕКАРСТВЕННОЕ РАСТЕНИЕ ГОРОХ

2.1 История введения в культуру

2.2 Ботаническая характеристика гороха

2.3 Электронно-микроскопическое исследование гороха

2.4 Фармакологические свойства лекарственного растения

3. АНАЛИЗ ЛИПИДОВ ГОРОХА

3.1 Определение липидов

3.2 Методика выделения и очистки фитостеринов

3.3 Количественное определение и содержание ситостерина в семенах гороха

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Настоящий период развития отечественной медицины и фармации характеризуется отчетливой тенденцией к более интенсивному использованию лекарственных средств растительного происхождения. В связи с этим одной из важных проблем фармации является изыскание новых растительных источников биологически активных веществ и создание на их основе эффективных лекарственных препаратов.

Представители семейства Бобовые, такие как горох посевной, соя, фасоль и другие представители семейства широко известны как ценные пищевые продукты. В тоже время эти представители имеют значение и в медицине. Так из фасоли выделены лектины (фитогемагглютинины — ФГА), обладающие гемагглютинирующей способностью и имеющие применение в медицинской практике. Горох посевной, применяется в народной медицине как мочегонное, гипогликемическое средство, а также для лечения воспалений кожи, экземы и гнойных ран. Известно, что горох богат фитостеринами.

Фитостерины (стерины растительного происхождения, предшественники липидов) — это вещества, которые показали биологическую эффективность, ингибируя пролиферацию и индуцируя апоптоз в клетках солидных опухолей толстой кишки и молочной железы человека, а также являются важными для снижения уровня холестерина.

В связи с тем, что горох, соя и другие белок содержащие растения являются наиболее доступными источниками питания, то для профилактики различных заболеваний представляется интересным исследование традиционных для нашей страны пищевых продуктов с целью выявления из них биологически активных комплексов.

В настоящее время в мире исследование биологической активности фитостеринов является одной из самых популярных направлений научных исследований. Количество публикаций по этому направлению не уступает количеству публикаций, например, по онкологии.

Популярность и актуальность этого направления связана с высокой биологической активностью этих соединений, способных снижать риск развития онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний более чем на 20%.

В качестве доставки фитостеринов в организм человека нами была выбрана липосомальная форма. Липосомы близки по химическому составу с природными мембранами клеток, поэтому при их введении в организм они не вызывают негативных и аллергических реакций.

Липосомы способны переносить широкий круг фармакологически активных веществ: противоопухолевые и противомикробные препараты, гормоны, ферменты, вакцины. Включенные в липосомы лекарственные вещества становятся более устойчивыми в организме, так как изолированы липидной мембраной, благодаря которой обеспечивается их направленная доставка.

Исходя из вышеперечисленного, научные исследования, посвященные разработке технологии получения фитостеринов из семян гороха и стандартизации липосомальных форм, предназначенных для повышения иммуномодулирующей активности организма, являются актуальными в настоящее время.

Цель исследования

Целью настоящей работы явилось изучение биологической активности липидов гороха и выявление их роли в здоровье человека.

Задачи исследования

1. Исследовать липиды, их классификацию, строение и функции.

2. Изучить физические и химические свойства липидов

3. Рассмотреть лекарственное растение горох, история введения его в культуру.

4. Провести электронно-микроскопическое исследование

5. Изучить фармакологические свойства лекарственного растения

6. Исследовать методики определения липидов гороха.

7. Разработать методику выделения и очистки фитостеринов гороха.

8. Рассчитать количественное определение и содержание ситостерина в семенах гороха.

Научная новизна исследования

Заключается в том, что на основании проведенных комплексных исследований впервые разработан рациональный метод технологии выделения фитостеринов из семян гороха.

Разработан метод количественного определения ситостерина в экстрактах из семян гороха.

Выявлен качественный и количественный состав липидов гороха и определена их биологическая активность.

Предложена новая липосомальная лекарственная форма из семян гороха, для использования в медицине и в качестве биологически активной добавки к пище.

Впервые выявлено иммуномодулирующее действие липосомальных форм из семян гороха.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования

Разработана методика выделения и очистки фитостеринов гороха с их дальнейшей идентификацией и определением физико-химических свойств.

Изучена биологическая активность фитостеринов и влияние степени их очистки на биологические свойства.

Созданы липосомы направленного действия, в состав которых входит ситостерин, для обеспечения адресной доставки препарата в опухолевые клетки.

1. ЛИПИДЫ И ИХ КЛАССИФИКАЦИЯ

1.1 Липиды

Липидами (от греч. lipos — жир) называют сложную смесь органических соединений с близкими физико-химическими свойствами, которые содержатся в растениях, животных и микроорганизмах. Их общими признаками являются: нерастворимость в воде (гидрофобность) и хорошая растворимость в органических растворителях (бензине, диэтиловом эфире, хлороформе и др.).

Элементный анализ жиров был проведен в XIX в. А. Лавуазье.

В 1779 г. К. Шееле установил, что в состав жиров входит глицерин.

В 1808 г. М. Э. Шёврель установил, что мыло — натриевая соль высшей жирной кислоты. Впервые были получены стеариновая, олеиновая, капроновая кислоты. Показал, что жиры состоят из глицерина и жирных кислот, причем это не просто смесь, а соединение, которое, присоединяя воду, распадается на глицерин и кислоты.

Шёврель вместе с Ж. Гей-Люссаком предложил способ получения стеариновых свечей.

Синтез жиров осуществил в 1850-х годах Марселен Бертло, нагревая в запаянных стеклянных трубках смесь глицерина с жирными кислотами. Методом синтеза он установил строение жиров.

Фосфолипиды были выделены М. Гобли в 1847г., а затем получены в более чистом виде Ф.А. Хоппе-Зейлером в 1877 г.

Липиды широко распространены в природе. Вместе с белками и углеводами они составляют основную массу органических веществ всех живых организмов, являясь обязательным компонентом каждой клетки.

В растениях они накапливаются главным образом в семенах и плодах. Содержание в них липидов зависит не только от индивидуальных особенностей растений, но и от сорта, места и условий произрастания.

Функции липидов в растительных организмов можно разделить на две группы: запасные липиды жировых депо и цитоплазматические липиды, т.е. входящие в состав протоплазмы и клеточных оболочек.

По химическому строению липиды отличаются большим разнообразием. Молекулы их построены из различных структурных компонентов, в состав которых входят спирты и высокомолекулярные кислоты, а в состав отдельных групп липидов могут также входить остатки фосфорной кислоты, углеводов, азотистых оснований и другие компоненты, связанные между собой различными связями.

В растениях липиды накапливаются главным образом в плодах и семенах. В таблице 1 представлены плоды и семена некоторых растений и их процентное содержание липидов.

Таблица 1. Содержание липидов в плодах и семенах растений

У большинства бобовых культур содержание в зерне липидов составляет 2 — 3 %, они в основном представлены жирами и фосфоглицеридами, которые локализованы преимущественно в зародыше. В семядолях синтезируются структурные липиды. У некоторых бобовых растений (нут, соя, люпин) в семенах может накапливаться значительно больше липидов, главным образом за счёт синтеза жиров.

Особенно много жира содержится в зерне сои (15 — 25 %), у которой поступающие из вегетативных органов углеводы используются не на синтез крахмала, а на образование ацилглицеринов, в связи с чем соя является не только высокобелковой, но и масличной культурой.

Семена люпина пока не используют для производства масел, хотя содержание масла и важных жирных кислот с точки зрения пригодности для пищевых и технических целей (простые и многократно ненасыщенные жирные кислоты) неплохое.

1.2 Функции и строение липидов

Функции и биологическая роль липидов_:

1. Структурные компоненты клеточных мембран, определяют функционирование мембран. Структурные липиды образуют сложные комплексы с белками (липопротеиды) и углеводами, из которых построены мембраны клеток и клеточных структур, и играют роль регуляторов в метаболических процессах, протекающих в клетке. Большую часть этой группы составляют фосфолипиды, однако сюда также входят глико-, сульфо- и некоторые другие липиды.

2. Защитная функция — термоизоляционные свойства, в виде жировой прокладки предохраняют тело и органы от повреждений, смазка кожи, восковой налет на листьях предохраняет их от испарения влаги и проникновения микроорганизмов).

3. Энергетический материал для организма (1 г жира при окислении выделяет 39 кДж энергии).

4. Запасные вещества, в форме которых депонируется метаболическое топливо. Запасные липиды (в основном ацилглицериды) являются энергетическим резервом организма и участвуют в обменных процессах. В растениях они накапливаются главным образом в плодах и семенах.

5. Влияние на функционирование нервной системы (гликолипиды — компоненты нервных тканей).

6. Регуляторная активность (простагландины, полипроноловые коферменты), мембранные липиды определяют активность мембраносвязанных ферментов.

Общее в строении липидов — присутствие в молекулах полярных (гидрофильных) и неполярных (гидрофобных) групп. Это придает им сродство как к воде, так и к неводной фазе. Липиды — бифильные вещества, что позволяет им осуществлять свои функции на границе раздела фаз.

Структурными компонентами омыляемых липидов являются высшие жирные кислоты, они были выделены из жиров, поэтому и получили соответствующее название. Биологически важные жирные кислоты — как правило, насыщенные и ненасыщенные монокарбоновые кислоты (одна или несколько двойных связей) с четным числом атомов углерода.

Общее количество атомов углерода в молекулах природных жирных кислот колеблется в диапазоне 4-12 (чаще всего 16-18 атомов углерода). Причём ближайшая к карбоксильной группе двойная связь обычно расположена между 9-м и 10-м углеродным атомом.

Двойные связи имеют цис-конфигурацию. В липидах человека из насыщенных кислот встречаются пальмитиновая и стеариновая, а из ненасыщенных — олеиновая, линолевая, линоленовая и арахидоновая. Калиевые и натриевые соли жирных кислот называют мылами (натриевые — твердые, калиевые — жидкие).

1.3 Классификация липидов

1. По химическому составу липиды делятся на простые и сложные.

Простые липиды не содержат азота, фосфора и серы. К ним относятся главным образом нейтральные липиды, являющиеся производными высших жирных кислот, одно-, двух- и многоатомных спиртов, альдегидов (ацилглицерины, эфиры диолов, воски, алкильные липиды, плазмалогены), а также их структурные компоненты (спирты, карбоновые кислоты).

Сложные липиды делятся на фосфолипиды (другое общеупотребительное название — «полярные липиды» ) и сфинголипиды. Фосфолипиды — соединения, при гидролизе которых образуются наряду со спиртами и высокомолекулярными жирными кислотами фосфорная кислота, азотистые основания, аминокислоты и ряд других соединений.

Сфинголипиды содержат сфингозиновые основания, являющиеся длинноцепочечными аминодиолами.

В состав простых и сложных липидов также могут входить гликолипиды, содержащие в качестве структурных компонентов углеводные фрагменты.

Иногда в самостоятельные группы липидов выделяют жирорастворимые пигменты, стерины, жирорастворимые витамины. Некоторые из этих соединений могут быть отнесены к простым липидам, другие — к сложным.

2. По отношению к щелочам липиды делятся на две большие группы: омыляемые и неомыляемые.

К группе омыляемых липидов относятся простые и сложные липиды, которые при взаимодействии со щелочами гидролизуются с образованием солей высокомолекулярных кислот, называемых «мылами».

Мыла, соли высших жирных (С₈-С₁₈), нафтеновых и смоляных кислот; одни из основные моющих средств. Технические смеси водорастворимых (калиевых, натриевых, аммониевых и три-этаноламмониевых) солей этих кислот называют щелочными мылами, водонерастворимые соли, содержащие металлы II, III и др. гр. (например, Са, Mg, Ni, Mn, Al, Co, Pb и др.)-металлическими.

Щелочные мыла получают главным образом из стеариновой, пальмитиновой, лауриновой, олеиновой, нафтеновых кислот, канифоли и таллового масла.

К неомыляемым липидам относятся соединения, не подвергающиеся щелочному гидролизу (стерины, жирорастворимые витамины, простые эфиры и т. д.)

стеройды

1.4 Физические и химические свойства липидов

Физические свойства

• Животные жиры плавятся при высокой t0C

• Растительные жиры при низкой t0С

• Высокая вязкость

• Слабо проводят тепло и электричество

• Плохо растворяются в воде

• Растворяются в бензине, бензоле, хлороформе

Химические свойства

Гидролиз

Омыляемые липиды подвергаются кислотному и щелочному гидролизу. In vivo гидролиз липидов катализируется специальными ферментами — липазами, для гидролиза каждого типа связи существует своя липаза, гидролиз происходит по стадиям, при этом, например в случае фосфолипида, образуются: глицерин, две жирные кислоты, фосфорная кислота и характеристическая группа (в зависимости от типа фосфолипида).

Окисление липидов растений

Многочисленные исследования последних десятилетий показали, что независимо от природы воздействия, ответ растения на него развивается по некоторой общей схеме, что позволяет говорить о существовании неспецифической стрессовой реакции на воздействия извне.

Таким универсальным звеном в реакции растительного организма на действие самых разнообразных факторов может быть некоторое стереотипное изменение внутренней среды клетки, на роль которого многие исследователи выдвигают окислительный стресс. Большое внимание в последнее время уделяется механизмам ответа живых систем на слабые внешние воздействия.

Предполагается, что действие факторов, по силе не выходящих за зону толерантности организмов, формируется не вследствие прямого повреждающего эффекта стрессора, а в результате разбалансирования процессов повреждения и восстановления клеточных структур.

В связи с этим исследование слабых воздействий может способствовать выявлению механизмов тонкой регулировки внутренних процессов, происходящих при внешних возмущениях. В клетке постоянно протекают окислительно-восстановительные процессы, способные приводить к появлению активных форм кислорода (АФК). Наиболее эффективно этот процесс идет на сопрягающих мембранах митохондрий и хлоропластов.

Хлоропласты являются теми структурами растительной клетки, в которых образование АФК происходит с наибольшей эффективностью. В силу своей высокой активности, АФК способны вызывать повреждение важнейших биополимеров: нуклеиновых кислот, белков, липидов и углеводов.

Поэтому неотъемлемой чертой всех аэробных организмов является неферментативное окисление биологических молекул по радикальному механизму с участием кислорода. АФК генерируют органические гидропероксиды ROOH, подобные по структуре пероксиду водорода и также химически активные. При последующем метаболизме они переходят в спирты, альдегиды, эпоксиды и т.д. Этот процесс называется перекисным окислением, а совокупность этих реакций — окислительными модификациями молекул.

Однако наиболее активно свободнорадикальное окисление идет при атаке инициирующим радикалом диаллильного атома углерода, в связи с этим в реакцию наиболее активно вступают полиненасыщенные жирные кислоты липидов мембран. В растениях окислению подвергаются преимущественно линолевая, линоленовая и олеиновая кислоты.

Первичными продуктами перекисного окисления липидов являются пентадиенильные радикалы, образующие диеновые конъюгаты и гидроперекиси жирных кислот. Дальнейшее их окисление и распад приводит к образованию широкого спектра конечных продуктов: альдегидных и спиртовых производных с укороченной цепью, в частности 4-гидрокси-2-ноненаль, низкомолекулярные продукты (этан, пентан), малоновый диальдегид, эпоксиды.

Наличие ненасыщенных кислотных остатков в молекулах липидов обусловливает их чувствительность к действию окислителей. Особенно опасным с точки зрения разрушения клеточных мембран, в состав которых входят фосфолипиды, является т.н. пероксидное окисление, происходящее под действием свободных радикалов. Окисление происходит в мягких условиях и приводит к образованию гидропероксидов.

Основным источником свободных радикалов в организме является кислород. Пероксидные радикалы возникают при взаимодействии молекулы кислорода с ионами тяжелых металлов, например ионами железа(II).

Другой тип свободных радикалов — гидрокидные радикалы НО^. — возникает из молекулы воды под действием жесткого излучения.

Пероксидные и гидроксидные радикалы действуют избирательно, атакуя связи С-Н метиленовых групп в б-положении (аллильном положении) к двойной связи С=С. При этом образуются наиболее стабильные в данном случае радикалы аллильного типа (рис. 13).

Свободные радикалы аллильного типа могут вступать в различные реакции с молекулами кислорода и воды, с образованием гидропероксидов. Гидропероксиды неустойчивы. Они подвергаются дальнейшим превращениям, что в итоге приводит к разрыву связи С-С у атакуемого атома. При этом сначала образуются альдегиды, которые легко окисляются в кислоты.

Таким образом, наличие свободных радикалов в организме вызывает цепь реакций, изменяющих структуру, и, следовательно, биологическую функцию молекул, подвергшихся пероксидному окислению.

Стадии перекисного окисления липидов

1) Инициация: образование свободного радикала (L*)

Инициирует реакцию чаще всего гидроксильный радикал, отнимающий водород от СН₂-групп полиеновой кислоты, что приводит к образованию липидного радикала.

2) Развитие цепи

L * + О₂ > LOO *LOO* + LH > LOOM + LR*

Развитие цепи происходит при присоединении О₂, в результате чего образуется липопе-роксирадикал LOO* или пероксид липида LOOH.

ПОЛ представляет собой свободнорадикальные цепные реакции, т.е. каждый образовавшийся радикал инициирует образование нескольких других.

3) Разрушение структуры липидов

Конечные продукты перекисного окисления полиеновых кислот — малоновый диальдегид и гидропероксид кислоты.

4) Обрыв цепи — взаимодействие радикалов между собой:

LOO* + L* > LOOH + LH

L* + vit E > LH + vit E*

vit E* + L* > LH + vit Е_окисл.

Развитие цепи может останавливаться при взаимодействии свободных радикалов между собой или при взаимодействии с различными антиоксидантами, например, витамином Е, который отдаёт электроны, превращаясь при этом в стабильную окисленную форму.

Выход окислительных процессов из-под контроля может быть губителен для клетки, однако в то же время существует представление об АФК, как о нормальных и даже необходимых метаболитах аэробной клетки. В общем случае ПОЛ является универсальным модификатором свойств биологических мембран, важным физиологическим регулятором их структуры и функций, фактором, устанавливающим и поддерживающим стационарное функционирование ферментов, каналообразователей, рецепторов.

2. ЛЕКАРСТВЕННОЕ РАСТЕНИЕ ГОРОХ

2.1 История введения в культуру

По научным данным, горох — одна из древнейших культур, имеющая возраст. Он возделывался уже в каменном веке наряду с пшеницей, ячменем, просом, чечевицей. Его родиной на основании археологических находок считают Переднюю Азию, где до сих пор выращивают мелкосеменные формы гороха. Крупносеменные формы возникли, как показал Н. И. Вавилов, в восточном Средиземноморье. Также возможно, что горох был завезен из Греции в Италию племенами ариев за 2000 лет до нашей эры.

Родоначальником культурного гороха, возможно, был горох однолетний (Pisum elatius Bieb.), встречающийся дикорастущим и поныне.

Горох считался самым главным весенним лекарством в средневековой Европе. Первоначально он выращивался исключительно ради его сухих семян, и даже в наши дни некоторые сорта активно возделываются ради лущеного гороха на суп. Зеленый горошек не упоминается в письменных источниках вплоть до завоевания Англии норманнами, а садовый горох не получал распространения до XVIII века.

Настоящий сахарный горошек растет главным образом в Европе и малоизвестен в Соединенных Штатах. Из-за большой популярности китайской кухни в Америке выращивается и собирается урожай сорта гороха, в котором ценятся толстые, мягкие, зеленые стручки их кладут в блюда китайской кухни.

Существует больше 1000 культурных сортов гороха в одной только Америке. Между тем лишь несколько из них ценны с коммерческой точки зрения. Они могут быть классифицированы в основном как высокие или карликовые, ранние или поздние, с маленькими или большими стручками.

Самым популярным сортом гороха явно является Аляскинский высокий, очень ранний, с маленькими горошинами. Если посадить его в начале мая, этот сорт можно убирать примерно через шестьдесят два дня. Многие другие сорта почти равны ему по популярности, например, такие, как Литл Марвэл, Лэкстон, Гредэс, Джайант Страйд.

2.2 Ботаническая характеристика гороха

Горох (Pisum L.) представлен несколькими видами, из которых наиболее распространен полиморфный вид Р. sativum L, — горох культурный посевной. Он имеет несколько подвидов. Главные из них:

1) ssp. sativum — горох посевной с белыми цветками и светлыми однотонными семенами (белыми, розовыми, зелеными);

2) ssp. arvense — горох полевой (пелюшка) с красно-фиолетовыми цветками и темными, часто крапчато-окрашенными угловатыми семенами; прилистники с красными антоциановыми пятнами

Горох посевной — Pisum sativum L. — однолетнее растение из семейства бобовых (Fabaceae, или Leguminosae) со стержневой корневой системой и слабым полегающим стеблем длиной от 20 до 250 см (у штамбовых сортов стебель не полегает). Листья с 1 — 3 парами листочков и длинными ветвистыми усиками, которыми заканчивается лист. В основании каждого листа по 2 полусердцевидных крупных прицветника, играющих такую же роль в фотосинтезе, что и листья. Листочки обычно сизо-зеленые от воскового налета.

Цветки расположены в пазухах листьев по одному или парами. Они крупные, длиной от 1,5 до 3,5 см, с белым, реже желтоватым, розовым, красноватым или лиловым венчиком. Характерно строение цветка гороха, как и других бобовых. У него двойной 5-членный околоцветник.

Чашечка не представляет собой ничего интересного, а вот венчик выглядит необычайно занятно. Его верхний лепесток, обычно самый крупный, с расширенным отгибом, зовут парусом, или флагом. Два противолежащих боковых лепестка называются веслами, или крыльями. А два нижних лепестка обычно срастаются между собой и образуют своеобразное корытце оригинальной формы, называемое лодочкой.

Таким образом, венчик гороха при некоторой фантазии можно сравнить с парусной лодочкой, снабженной веслами. В цветке 10 тычинок и пестик с верхней завязью. 9 тычинок срастаются между собой нитями и образуют трубку, внутри которой проходит столбик пестика, а одна тычинка остается свободной. Самоопыляющееся растение, но в годы с жарким сухим летом бывает и перекрестное опыление.

Плод гороха, как и всех бобовых, — боб. Ему обязано семейство своим названием. Бобы у гороха чаще прямые, реже изогнутые, почти цилиндрические, длиной от 3 до 15 см, с белыми или бледно-зелеными створками, называемыми в народе кожурой. В каждом бобе от 3 до 10 довольно крупных семян.

В обиходе плоды гороха нередко зовут стручками, что ботанически абсолютно неверно, так как стручки присущи только растениям, относящимся к семейству крестоцветных.

Характерной особенностью бобовых, в том числе характеризуемого нами гороха, является симбиоз с микроорганизмами, способными усваивать атмосферный азот. Они живут внутри особых клубеньков, вырастающих на корнях бобовых. Микроорганизмы получают от бобовых воду с минеральными солями. Для бобовых симбиоз полезен тем, что они в течение жизни используют для своего минерального питания часть азотных соединений, образовавшихся в корневом клубеньке за счет связывания азота воздуха. Это позволяет им поселяться и нормально расти на участках с бедной почвой.

Бобовые — одни из немногих растений, которые не истощают почвенное плодородие, а наоборот, его приумножают, обогащают почву азотными соединениями. Поэтому в полевых севооборотах посевы бобовых всегда считаются хорошими предшественниками для культур, которые будут сеять на данном поле после уборки бобовых.

Таблица 2. Значения температур, при которых идёт развитие растений гороха, ^оС

Горох — достаточно холодостойкая культура, переносит заморозки до -4°С. Семена начинают прорастать при 1 — 2 °С. Это позволяет выращивать его в самых северных районах, где еще возможно земледелие (до 68°северной широты). К тому же у него сравнительно короткий вегетационный период — от посева до созревания семян разные сорта укладываются в срок от 65 до 140 суток. Горох — светолюбивая культура, плохо переносящая засуху.

Горох требует слабокислых и нейтральных почв, поэтому своевременное известкование их — одно из важнейших условий формирования высокого урожая. Известковые материалы целесообразнее вносить под предшествующую культуру.

Если горох размещается на кислой почве, известкование проводят осенью пылевидной известью с хорошей заделкой ее в почву. Следует иметь в виду, что помимо снижения кислотности известкование улучшает другие физико-химические свойства почвы — снижается содержание подвижных соединений алюминия, железа, марганца, активизируется деятельность клубеньковых бактерий, улучшается фосфорное и молибденовое питание, что активизирует фотохимические процессы.

Районы возделывания и урожайность. Горох отличается весьма широким ареалом, его возделывают примерно в 60 странах мира. В мировом земледелии посевы гороха занимают около 15 млн. га, средняя урожайность его составляет 1,34 т/га, в развитых странах достигает 3,0-4,5 т/га. Основные посевы его сосредоточены в РФ и странах СНГ, возделывают его почти во всех странах Европы, в США, Канаде, Колумбии, Перу, Африке, Китае и Индии.

В нашей стране его возделывают почти повсеместно. Наибольшие площади под горохом находятся в Центрально-Черноземной и Нечерноземной зонах, в Татарстане, Чувашии, Мордовии, Башкирии, А также в лесостепи и Правобережье Украины, в Белоруссии и Прибалтике. В связи с выведением скороспелых и более засухоустойчивых сортов значительные площади эта культура стала занимать в Западной и Восточной Сибири, на Урале и в Казахстане. В засушливых районах юга и юго-востока его мало возделывают из-за невысокой засухоустойчивости и поражения гороховой зерновкой. В Средней Азии и Закавказье с осени сеют зимующие сорта гороха.

Заготовка

Лекарственным сырьем служат листья и семена. Листья собирают в мае-июне, сушат в тени, в хорошо проветриваемом помещении, разложив тонким слоем. Хранят в бумажных или тканевых пакетах. Срок хранения — 1 год. Семена советуют собирать на второй фазе Луны, вблизи полнолуния, в 13-й, 14-й лунные дни, утром, после восхода солнца. Сушат при температуре 50 °С на чердаках или в сушилках, хранят в закрытой таре до 3 лет.
Химический состав

Горох богат белком (26-27%), содержащим большое количество незаменимых аминокислот (тирозин, цистин, метионин, лизин, триптофан и др., которые по химическому составу и физиологическим свойствам наиболее близки к белкам животного происхождения), активные противосклеротические вещества — холин и инозит, а также крахмал, жир, витамины группы В, С, РР, провитамин А, минеральные соли (соли калия, фосфора, марганца и др.), клетчатка и микроэлементы.

В тканях бобовых накапливается много азотных соединений, необходимых для построения белковых молекул. Гороховая мука богата глютаминовой кислотой.

Липиды гороха состоят в основном из ненасыщенных жирных кислот 83-90 %, среди которых преобладает линолевая кислота 38,7 %.

Линолевая кислота

Объемная формула

Планарная формула.

Линолевая кислота (цис-9, цис-12-октадекадиеновая) — это наиболее распространенная и простая кислота с двумя двойными связями. Линолевая кислота не синтезируется тканями человека, но она необходима для роста, размножения и здорового развития, поэтому должна поcтупать с пищей. В тканях человека является биосинтетическим предшественником других полиеновых жирных кислот.

2.3 Электронно-микроскопическое исследование гороха.

Данные электронно-микроскопического исследования прилистников проростков гороха представлены на рис. 1.

Рис.1-А. Увеличение 6000 раз

Рис. 1-Б. Увеличение 60 000 раз

Рис. 1-В. Увеличение 18 000 раз

Рис. 1-Г. Увеличение 60 000 раз

2.4 Фармакологические свойства лекарственного растения

Обладает сахаропонижающим и мочегонным действием. Отвар травы и семян гороха принимают при мочекаменной болезни. Припарки из гороховой муки рекомендуют для размягчения твердых воспалительных инфильтратов при нарывах, фурункулах и карбункулах.

Из гороховой муки делают очищающие косметические маски. У горохового масла обнаружены гормоноподобные свойства.

В пищу употребляют сладкие бобы сахарных сортов гороха — так называемые лопатки, створки которых сохраняют сочность до конца восковой спелости. Внутри бобов сахарного гороха нет пергаментного слоя, поэтому их употребляют в пищу целиком.

У лущильных сортов с внутренней стороны створок боба имеется кожистый несъедобный слой. Молодые бобы лущат, в пищу используют недозрелые семена под названием зеленый горошек. Из свежих всходов гороха готовят витаминные салаты. Зрелые семена гороха используют в вареном виде в супах, кашах, пюре, консервах и т.д.

Лечебные свойства

Этот щелочной овощ выдающийся источник витаминов A, Bi и С. В стручках очень много хлорофилла, железа и веществ, контролирующих содержание в организме кальция. Шелушеный горох лишается витаминов и важных микроэлементов.

Горох содержит пиридоксин, участвующий в расщеплении и синтезе аминокислот. Недостаток этого витамина вызывает дерматит и судороги. За большое содержание селена горох рассматривают, как антиканцерогенное средство.

Горох блокирует поступление в организм радиоактивных металлов. В народной медицине отвар ботвы и плодов гороха применяют, в качестве мочегонного средства, способствующего растворению камней в почках.

Гороховую крупу (муку) используют в качестве припарок для размягчения фурункулов и карбункулов. Горох снижает вероятность онкологических заболеваний, инфаркта, гипертонии. Употребление гороха, в любом виде, замедляет процесс старения кожи и всего организма, в целом.

Белок гороха содержит незаменимые, для нашего организма, аминокислоты: лизин, метионин, триптофан, цистин и др.

Свежий садовый горох обладает легким мочегонным свойством. Он также дает облегчение при язвенных болях желудка, потому что помогает избавляться от кислот в желудке. Но при язве горох нужно есть в виде пюре.

У гороха нет других особо ценных целительных свойств. Люди, которым недостает витамина А, должны есть его сырым, в виде пюре или сока, не сочетать с крахмалосодержащими продуктами, чтобы получить максимальную пользу от содержащегося в нем витамина А.

Содержание питательных веществ в одном фунте (453,59 г)

Калории 201

Железо 3,9 мг

Белки 13,7 г

Витамин А 1,390 ME

Жиры 9,8 г

Тиамин 0,69 мг

Углеводы 36,1 г

Рибофлавин 0,33 мг

Кальций 45 мг

Ниацин 5,5 мг

Фосфор 249 мг

Аскорбиновая кислота 54 мг

Горох против рака

Видов продуктов, которые препятствуют росту раковых клеток, становится все больше. На этот раз к ним добавились горох и чечевица. Ученые Лондонского медицинского колледжа определили, что в этих продуктах содержится вещество с неблагозвучным названием инозитол пентакисфосфат, которое собственно и дает вышеописанный эффект, воздействуя на энзим фосфоинозитид 3-киназу.

Оценка иммуномодулирующей активности липидов, выделенных из зеленых семян гороха, оценивалась по их способности стимулировать спонтанную цитотоксическую активность МНПК здоровых доноров при испытании на линии опухолевых клеток К-562. В качестве препарата сравнения было использовано оливковое масло. Полученные данные свидетельствуют о том, что липиды гороха повышает цитостатическую активность МНПК, при этом активность липидов гороха превышает таковую для оливкового масла.

Выделенные из семян гороха липиды обладают иммуномодулирующими свойствами. Эти данные свидетельствуют о том, что семена гороха могут рассматриваться как ценный источник липидов, прежде всего ненасыщенных жирных кислот, с иммуномодулирующей активностью.

3. АНАЛИЗ ЛИПИДОВ ГОРОХА

3.1 Определение липидов

Определение содержания диеновых конъюгатов, степень диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот определяли по методике И.Д. Стальной (1977).

Для определения диеновых конъюгатов 0,5 мл суспензии растворяли в 4,5 мл смеси гептан: изопропиловый спирт в соотношении 1:1 и центрифугировали 10 мин при 4 тыс. об/мин.

К надосадочной жидкости добавляли 0,1 объема воды для разделения фаз. К 0,5 мл верхней гептановой фазы добавляли 2,5 мл этанола и спектрофотометрировали против контроля (гептан : спирт в соотношении 1 : 5).

В ходе ПОЛ на стадии образования свободных радикалов в молекулах НЖК возникает система сопряженных двойных связей, что сопровождается появлением нового максимума в спектре поглощения при 232 нм.

Расчет ДК производили по формуле

где Д₂₃₂ — оптическая плотность;

Е — коэффициент молярной экстинкции, 2,1^.10^-6 моль^-1. см^-1;

С — концентрация липидов, мг / мл.

Диеновые конъюгаты выражали в мкМоль ДК / мг липидов.

Содержание липидов проводили спектрофотометрически по реакции с фосфорно-ванилиновой смесью.

Обычно продукты перекисного окисления измеряют в хлоропластах проростков (в случае, когда речь идет о растениях), подверженных какому-либо воздействию, например, радиации. По этому поводу существует большое количество работ.

Однако, в проростках, выращенных из семян, подвергшихся какому-либо воздействию, продукты перекисного окисления не меряют.

Особых оснований полагать, что уровень продуктов перекисного окисления каким либо образом поменяется в таких проростках, нет.

Тем не менее окислительно-восстановительные процессы протекают на мембранных структурах, в том числе на мембранах хлоропластов, протекают постоянно за счет образования активных форм кислорода (АФК).

Результатом увеличения продукции АФК, как правило, является смещение прооксидантно-антиоксидантного равновесия в сторону интенсификации окислительных процессов, об активности протекания которых можно судить по накоплению продуктов ПОЛ.

В некоторых работах ПОЛ рассматривается как маркер неспецифического ответа организма на воздействие извне. ПОЛ — цепной процесс свободнорадикального окисления — приводит к образованию пентадиенильных радикалов, которые образуют диеновые и триеновые конъюгаты и гидроперекиси жирных кислот.

Конечными продуктами ПОЛ являются альдегидные и спиртовые производные гидроперекисей, низкомолекулярные продукты (этан, пентан), эпоксиды, малоновый диальдегид (МДА).

В нашей работе мы измеряли диеновые конъюгаты (первичные продукты ПОЛ) и основания Шиффа, которые образуются на более поздних стадиях.

Разумеется, для того чтобы определить окислительно- восстановительный статус клетки, нужно промерить большее количество продуктов ПОЛ, а также ферменты антиоксидантной системы, которые поддерживают окислительно — восстановительный баланс.

Однако, задачей данного исследования было посмотреть будет ли проявляться различие нахождение семян в разных условиях на продукты ПОЛ, образующихся в проростках из таких семян.

3.2 Методика выделения и очистки фитостеринов

При подборе растворителя на основе литературных источников использовали гептан и этанол. Разделение фракций осуществляли с помощью колоночной хроматографии на сефадексе LH-20 и матрицей LiChroprep.

Гептанрастворимую и этанолрастворимую фракции наносили на колонку уравновешенную этанолом. Последующее элюирование осуществляли ступенчатым элюатом с возрастающей его гидрофобностью.

Содержание гептанрастворимых фракций семян гороха приведено в таблице 3.

Таблица 3 Среднее содержание гептанрастворимых фракций желтых и зеленых семян гороха

* Средний вес гептанрастворимой фракции на 100 г гороховой муки. Приведены средние данные трех экспериментов

Как следует из таблицы 1 средний вес гептанэкстрагируемой фракции зеленых сортов гороха больше, чем средний вес гептанэкстрагируемой фракции желтых семян гороха составляет 1.8 и 1.3 г на 100 г гороховой муки соответственно. Для дальнейшей характеристики гептанрастворимых фракций были изучены их спектры поглощения (см. рис. 2).

Желтые и зеленые семена гороха значительно отличаются по количественному содержанию пигментов. В зеленых семенах, исходя из данных (рис. 2) спектра поглощения содержание пигмента в 5 раз выше, чем желтых.

Рис. 2 Спектры поглощения веществ экстрагированных гептаном из муки семян гороха. 1 -спектр поглощения веществ из желтых семян; 2 -спектр поглощения веществ из зеленых семян. Измерение проводили на спектрофотометре HP 8452 A с диодной матрицей

В зависимости от физико-химических свойств этого пигмента можно ожидать, что работа с зелеными семенами по выделению фитостеринов будет серьезно затруднена. Поэтому для выделения фракций фитостеринов с минимальной примесью пигментов в дальнейшем мы использовали экстракцию этанолом.

Исходя из данных литературы фитостерин обладает биологической активностью, когда он входит в состав пищевых продуктов. В то же время, очищенный ситостерин практически не обладает биологической активностью. Поэтому третья фракция (рис.4) подвергалась меньшей очистке. Максимальное содержание фитостеринов отмечалось во фракции III (рис. 5). Время удерживания ситостерина составило 9.19 секунды.

Для идентификации ситостерина было проведено сравнение масс-спектров эталонного ситостерина и ситостерина, входящего в состав фракции II (рис.6). Показано, что, как и эталонный ситостерин, ситостерин, входящий в состав гороха имеет молекулярный пик m/z 414. Кроме этого совпадают все m/z тяжелых ионов 396, 381, 329, 303, 273, 255 и т.д. Эти данные позволяют утверждать, что во фракции II идентифицирован ситостерин.

Дальнейшая наработка ситостерина и фитостерина были проведены по схемам (см. рис. 3 и 4).

Рис. 3. Схема очистки фитостеринов гороха

Рис. 4. Схема очистки фитостеринов гороха и получение фракции III

Газовохроматографический масс-спектр этаноловой фракции из желтых семян гороха и элюированной этанолом показан на рисунке 5.

Рис. 5. Газовохроматографический масс-спектр этаноловой фракции из желтых семян гороха и элюированной этанолом. Фракция III.

Рис. 6. Масс-спектр эталонного ситостерина (внизу) и ситостерина из образца гороха (вверху). По оси абсциис — m/z, по оси ординат — интенсивность (усл. ед.)

3.3 Количественное определение и содержание ситостерина в семенах гороха

Количественное определение ситостерина проводили по реакции Либермана-Бурхарда. Для количественного определения готовили раствор ситостерина с уксусным ангидридом и концентрированной серной кислотой, дающее зеленое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации ситостерина.

Чтобы исключить погрешности при количественном определении ситостерина в лекарственной форме, необходимо измерение оптической плотности испытуемого раствора проводить против раствора сравнения, содержащего соответствующие вспомогательные вещества в таком же разведении.

На рисунке 7 приведен спектр окрашенного комплекса ситостерина. Как видно из приведенного спектра окрашенный комплекс имеет три выраженных максимума поглощения 332 нм, 414 нм и 638 нм.

Отметим, что при 656 нм также присутствует максимум поглощения, но его интенсивность уступает трем ранее перечисленным пикам. Уксусный ангидрид предварительно перегоняют, чтобы удалить примесь уксусной кислоты и экзогенной окраски.

Количество ситостерина в пробе определяют по калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой измеряют экстинкции растворов ситостерина различной концентрации, полученных из стандартно приготовленного раствора ситостерина.

Спектр поглощения окрашенного комплекса ситостерина в реакции Либермана-Бурхарда. По оси абсцисс — длина волны в нм. По оси ординат — поглощение отн. ед. (рис. 7).

горох липиды фитостерин лекарственный

Рис. 7. Спектр поглощения окрашенного комплекса ситостерина в реакции Либермана-Бурхарда. По оси абсцисс — длина волны в нм. По оси ординат — поглощение отн. Ед

Рис. 8. Проверка выполнения закона Бугера-Ламберта-Бера. Кривая зависимости между поглощением окрашенного комплекса ситостерина при 638 нм от его концентрации в пробе

На рисунке 8 показана зависимость поглощения окрашенного комплекса ситостерина при 638 нм от количества его в пробе. Из результатов, представленных на рис. 6, видно, что поглощение раствора ситостерина подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера. Следовательно, в диапазоне указанных концентраций возможно с точностью (до 10 мкг на пробу), определить содержание фитостерина в пробе.

Данные по среднему количественному содержанию ситостерина в желтых и зеленых семенах гороха приведены на рисунке 9.

Как показано на представленном рисунке в желтых семенах гороха содержится в среднем более 62 мг ситостерина на 100 мг гороховой муки, тогда как в зеленых семенах почти в 4 раза меньше (менее 15 мг ситостерина на 100 мг гороховой муки).

Рис. 9. Содержание ситостерина в семенах гороха в мг на 100 грамм гороховой муки. По оси ординат количество ситостерина мг. По оси абсцисс желтые семена -, зеленые семена —

Таблица 2. Количественное содержание фитостеринов в различных сортах сои

Согласно данным, представленным на рисунке 9, и в таблице 2 семена гороха имеют более высокое содержание ситостерина, чем семена сои. Поэтому в дальнейших экспериментах был использован ситостерин, полученный из желтых семян гороха.

Семена гороха являются ценным источником различных липидных фракций, ряд из которых хорошо известны как биологически активные вещества, такие как бета-токоферол и ненасыщенные жирные кислоты.

В целом состав идентифицированных липидов у желтых и зеленых семенах гороха не отличается. Однако, среднее содержание гамма токоферола в два раза, а олеиновой кислоты в 1.4 раза выше в зеленых семенах гороха, тогда как среднее содержание ситостерина почти в 3 раза выше в желтых семенах гороха.

Таким образом, с помощью проведенных методов анализа газовой хроматографии и последующей масс-спектрометрией, удалось идентифицировать 18 липидов (табл. 3), которые по весу составляют около 24% липидов из общего количества веществ, которые были экстрагированы гептаном из желтых семенах гороха.

А в зеленых семенах гороха эти 18 липидов по весу составляют около 18% от общего количества экстрагированных веществ.

Таблица 3. Количественное содержание липидов в семенах гороха

Остальные вещества липидной природы не удалось идентифицировать указанным методом, так как их масс-спектры или времена удерживания не совпадали с библиотечными данными. Более 60% (из идентифицированных) липидов содержат уникальные ненасыщенные жирные кислоты и серосодержащие липиды.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время заметно возрос интерес к липидам со стороны всех направлений медико-биологической науки. Прежде всего, это связано с теми функциями, которые липиды выполняют в организме растений, животных и человека. Исследования двух последних десятилетий показали, что липиды не только источник и форма хранения информации.

Сложные липиды и их природные комплексы являются основой строения биологических мембран и в составе ее осуществляют важнейшие жизненные процессы. Установлено также, что серьезные поражения нервной системы, расстройства сердечно-сосудистой системы тесно связаны с нарушением обмена липидов.

Растительные жирные масла широко распространены в тканях растений. По современным представлениям, липиды являются обязательным компонентом живых клеток, хотя большинство растений накапливает сравнительно немного масла.

Наряду с этим в настоящее время известно несколько сот растений, у которых в тканях отдельных органов — плодов, семян, корневищ, коры, спор и пыльцы — откладываются в запас значительные количества жирных масел. У некоторых растений в семенах содержание липидов составляет до 50-70% от их массы.

Наибольшее количество запасных липидов, возможное для данного вида растений, обычно сосредоточено в семенах, в их активной ткани — зародыше семян и эндосперме, в то время как другие органы растений относительно бедны липидами.

Высокая концентрация липидов в отдельных органах растений позволила уже давно использовать их для промышленного получения растительных масел.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Государственная фармакопея СССР, Х издание. — М.: Медицина, 1968.

2. Государственная фармакопея СССР, ХI издание. — М.: Медицина, 1987 (выпуск 1), 1989 (выпуск 2).

3. Мир культурных растений. Справочник. Изд-во «Мысль». Москва, 1994г.

4. Совершенствование технологии возделывания гороха НЗ РФ. Автореферат. В.В.Малышев. Воронеж, 1999г.

5. Щепочкина О.Ю., Глинкина А.Е. Разработка методов определения биологически активных веществ в отдельных представителях семейства бобовых // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции», выпуск 63., Пятигорская государственная фармацевтическая академия, 2008г., С.522-523

6. Глинкина А.Е., Зайчикова С.Г., Щепочкина О.Ю., Доненко Ф.В. Выделение биологически активных веществ из отдельных представителях семейства Бобовые // Человек и лекарство: Тез. докл. XVII Росс. нац. конгр. — М., 2009-С. 639.

7. Глинкина А.Е., Краснюк И.И., Зайчикова С.Г. Выделение ингибиторов трипсина в семенах Бобовых // Человек и лекарство: Тез. докл. XVII Росс. нац. конгр. — М., 2009-С. 639.

8. Зайчикова С.Г., Глинкина А.Е., Доненко Ф.В., Тришин А.В., Градюшко А.Т. Иммуномодулирующая активность липидов гороха // Человек и лекарство: Тез. докл. XVII Росс. нац. конгр. — М., 2009-С. 661.

9. Глинкина А.Е., Краснюк И.И., Зайчикова С.Г., Тришин А.В., Доненко Ф.В. Выделение фитостеринов гороха и оценка их биологической активности Молекулярная медицина и биобезопасность: тез. Докл. V межд. конф. — М., 2008-С. 39-41.

10. Зайчикова С.Г., Тришин А.В., Глинкина А.Е. Фитоэстрогены — панацея или угроза здоровью? // Фармацевтическая биоэтика: III межд. конф. — М., 2007-С.50-52.

11. Краснюк И.И., Глинкина А.Е., Тришин А.В., Градюшко А.Т., Доненко Ф.В. Липиды гороха: состав и биологическая активность // журн. Фармация, №1, М., 2009-С.26-27.

12. Краснюк И.И., Глинкина А.Е., Тришин А.В., Градюшко А.Т., Доненко Ф.В. Ситостерин гороха: выделение и количественная оценка // журн. Фармация, №5, М., 2009-С.18-20.

13. Артемьева, Н.Н. Руководство к лабораторным занятиям по

органической химии: пособ. для вузов / Н.Н.Артемьева, В.Л. Белобородов, С.Э. Зурабян и др.; Под ред. Н.А. Тюкавкиной. — 2-изд., перераб. и доп. — М.: Дрофа, 2002.

14. Краснюк И.И., Глинкина А.Е., Тришин А.В., Градюшко А.Т., Доненко Ф.В. Ситостерин гороха: биологическая активность // журн. Фармация, №7, М., 2009-С.38-40.

15. Хроматография на бумаге / Под ред. И. Хайса, К. Мацека. М.: Иностр. лит., 1992.

16. Глинкина А.Е., Краснюк И.И., Зайчикова С.Г., Доненко Ф.В. Разработка липосомальных форм с ситостерином, обладающих иммуномодулирующей активностью // Молекулярная медицина и биобезопасность: тез. Докл. V межд. конф. — М., 2009-С. 64-64.

17. Мак-Нейр, Г. Введение в газовую хроматографию / Г. Мак-Нейр, Э. Бонел-ли. — М.: Мир, 1990